多肽FRET修饰

FRET(荧光共振能量转移)是一种距离依赖的通过将供体分子的激发态能量转移到受体分子,从而导致荧光淬灭的过程。FRET是指在一定距离内,处于激发态的荧光团(供体)将能量非辐射地转移给邻近的荧光团(受体)分子的过程。FRET通过分子间的电偶极相互作用,将供体激发态能量转移到受体激发态,使供体荧光强度降低,而受体可以发射更强于本身的特征荧光(敏化荧光),也可以不发荧光(荧光猝灭)。能量转移效率取决于供体和受体光谱的重叠程度、它们的相对取向以及两者之间的距离。根据Förster理论,能量转移效率与距离的六次方成反比,即距离每增加一倍,能量转移效率降低至原来的1/64。
FRET发生的条件包括:

供体的发射光谱与受体的吸收光谱有重叠;

供体和受体之间的距离在1 - 10纳米(1纳米=10埃,C-C单键长为1.5埃左右)范围内;

供体和受体的跃迁偶极具有适当的相对取向。

FRET多肽通常标记有标有供体分子(荧光基团)和受体分子(淬灭基团)。FRET多肽可以标记同一种荧光分子,但是在大多数情况下,荧光基团和淬灭基团是两种不同的染料分子。如果荧光受体是非荧光染料(淬灭基团),则荧光供体转移的能量将转化为分子振动。当FRET终止时(荧光供体和受体分离),可以检测到供体荧光的增加。当供体和受体均为荧光染料时,转移的能量将作为波长较长的荧光的光被发射出来,这样,供体和受体荧光的强度比例将会有一个改变从而可以被检测出来。

FRET的应用

酶活性检测;

酶药物靶点的筛选和发现;

酶抑制剂高通量筛选。

TR-FRET(Time-resolved FRET)标记技术

TR-FRET是指使用稀土金属元素例如铕(Eu)作为荧光供体分子,这种荧光供体分子的荧光寿命要长于背景干扰荧光,其特点为斯托克位移(激发峰位和发射峰位的波长之间的差)大,使激发波和发射波之间的串扰降低,从而得到很高的信噪比。TR-FRET分析灵活,可靠,灵敏度高,通量高,且得到的假阳性/假阴性结果较少。
偶联DOTA的多肽通常被用于TR-FRET技术,通常通过DOTA将稀土金属元素螯合到多肽上。

常用的FRET荧光组合对

供体(荧光染料)

Trp (Tryptophan)

Trp (Tryptophan)

Mca (7-Methoxycoumarin-4-yl)acetyl)

Abz (2-Aminobenzoyl)

Abz (2-Aminobenzoyl)

Abz (2-Aminobenzoyl)

Abz (2-Aminobenzoyl)

Abz (2-Aminobenzoyl)

N-Me-Abz(N-Methyl-anthraniloyl)

EDANS (5-[(2-Aminoethyl) amino] naphthalene-1-sulfonic acid)

5-FAM (5-Carboxyfluorescein)

5-FAM (5-Carboxyfluorescein)

CP488

Lucifer Yellow

FITC (Fluorescein isothiocyanate)

Dansyl (5-(Dimethylamino) naphthalene-1-sulfonyl)

5-TAMRA (Carboxytetramethyl rhodamine)

5-TAMRA (Carboxytetramethyl rhodamine)

Eu(III) Chelate

Cy5

Cy5.5

颜色

最大吸收波长

280nm

280nm

325nm

320nm

320nm

320nm

320nm

340nm

340nm

430nm

492nm

492nm

495nm

430nm

490nm

342nm

547nm

547nm

340nm

647nm

648nm

最大发射波长

360nm

360nm

392nm

420nm

420nm

420nm

420nm

420nm

440nm

490nm

512nm

512nm

519nm

520nm

520nm

562nm

573nm

573nm

613nm

665nm

701nm

消光系数M-1 cm-1 (ε)

5,600

5,600

11820

/

/

/

/

/

/

5,900

83,000

/

/

11,000

73,000

3,300

90,000

/

/

/

/

受体(淬灭基团)

Dnp (2,4-Dinitrophenyl)

4-Nitro-Z (4-Nitro-benzyloxycarbonyl)

Dnp (2,4-Dinitrophenyl)

Dnp (2,4-Dinitrophenyl)

EDDnp(N-(2,4-Dinitrophenyl)ethylenediamine)

pNA (para-Nitroaniline)

3-Nitro-Tyr (3-Nitro-tyrosine)

4-Nitro-Phe (4-Nitro-phenylalanine)

Dnp (2,4-Dinitrophenyl)

Dabcyl (4-(4-Dimethylaminophenylazo)benzoyl)

CPQ2

Dabcyl (4-(4-Dimethylaminophenylazo)benzoyl)

CPQ2

Dabsyl (4-(4-Diethylaminophenylazo)-benzenesulfonyl)

Dnp (2,4-Dinitrophenyl)

4-Nitro-Phe (4-Nitro-phenylalanine)

QSY7

BHQ3

QSY-7

QSY21

QSY21

常规FRET供体(Donor)-接受(Aceptor)对的福斯特临界距离(Forster Critical Distance)

  • 供体(荧光染料)
  • Tryptophan
  • IAEDANS(5-(2-iodoacetylaminoethyl)aminonaphthalene-1-sulfonic acid)
  • BFP
  • Dansyl
  • Dansyl
  • CFP
  • CF(carboxyfluorescein succinimidyl ester)
  • Fluorescein
  • Cy3
  • GFP
  • BODIPY FL(4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene)
  • Rhodamine 6G
  • FITC
  • B-Phycoerythrin
  • Cy5
  • 受体(淬灭基团)
  • Dansyl
  • DDPM(N-(4-dimethylamino-3,5-dinitrophenyl) maleimide)
  • DsRFP
  • FITC
  • Octadecylrhodamine
  • GFP
  • Texas Red
  • Tetramethylrhodamine
  • Cy5
  • YFP
  • BODIPY FL(4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene)
  • Malachite Green
  • Eosin Thiosemicarbazide
  • Cy5
  • Cy5.5
  • 福斯特临界距离(nm)
  • 2.1
  • 2.5-2.9
  • 3.1-3.3
  • 3.3-4.1
  • 4.3
  • 4.7-4.9
  • 5.1
  • 4.9-5.5
  • 5.0
  • 5.5-5.7
  • 5.0
  • 6.1
  • 6.1-6.4
  • 7.2
  • >8.0