点击化学的概念来自巴里·夏普莱斯在21世纪初发表的一篇文章。夏普莱斯认为，让碳原子之间形成化学键是化学合成的一大障碍，来自不同分子的碳原子往往缺乏成键的化学动力，而人工激活反应的过程会导致许多不必要的副产物。他提出一种更容易掌控的路径，即利用氮原子或氧原子作为“桥梁”，将具有完整碳骨架的小型分子拼接起来。这种方法被称为点击化学。点击化学具有反应迅速，产率高，操作简便，没有副产物、无需除水除氧等优点。
       对比传统偶联反应，点击化学的优点很明显，同时在应用场景中对于药物偶联、标记更精准。

        点击化学是一种间接高效的化学合成方法。在活细胞或者生物体内开展的点击化学反应，我们称为生物正交化学，这个反应不影响机体本身生物化学过程实现标记或药物递送。这也是点击化学在药物研发，分子生物学等领域的重要应用。多肽里的"点击化学"，本质是用叠氮（–N₃）/炔烃（–C≡CH）这对生物正交手柄，在温和条件下把两个片段连成稳定的 1,2,3-三唑环。在三唑键里，叠氮和炔基互不干扰多肽自身的 NH₂/COOH/SH，所以能在水相、近中性 pH 下做定点修饰，是多肽环化、订书（stapling）、PDC/荧光标记的主流工具之一。
         目前，点击化学主要有三条主力路线：
        1. CuAAC 铜催化点击（端炔 + N3）
       点击化学最经典的路线就是CuAAC 铜催化点击（端炔 + N3），这个方法原理：叠氮+末端炔基+Cu(常用 CuSO₄/抗坏血酸钠原位还原) → 1,4-三唑。

三唑环平面性好、有偶极矩，常作为酰胺键生物电子等排体，抗水解、抗蛋白酶，这个反应定量、区域选择性好。成本相对较低。在这个经典的路线中，CuSO₄作为铜离子的来源，CuSO₄的二价铜离子被抗坏血酸钠还原为一价铜离子，只有在一价铜离子的催化下反应才能完成。这个路线的缺点是Cu对细胞/蛋白有毒，易产生活性氧，体内或敏感蛋白偶联后必须螯合除铜（Chelex、EDTA）。
        铜催化点击化学（CuAAC）用铜离子催化，让“叠氮”和“端炔”在水里快速、专一地连成三唑环，像分子乐高一样把不同模块拼在一起。如此简单高效的反应应用领域也十分广泛。在生物医药上给蛋白/核酸/糖加标签，链接新药分子、连抗体和药物、做放射性探针，功能高分子、水凝胶、纳米颗粒表面修饰以及固定识别分子，做生物传感器和诊断试剂……这些领域都离不开这个经典的反应。
        2023年发表在Peinuts上的一篇文章很好的体现了这个经典反应的应用，他们做了一个基于CuAAC反应为基础的药物筛选研究工作。文献案例中PF-06372222是一个GLP-1R的拮抗剂，研究人员通过对PF-6372222这个拮抗剂做了一个和GLP-1R的位点结合的分析，一共分析到了10个关键位点，基于这10个关键位点设计了吻合结构的10个炔基修饰的骨架。在此之前他们得到了得到的3840个叠氮化合物，利用两两正交点击化学反应，共得到了38400个产物，后续通过LC-MS，生物亲和检测等实验手段，快速高通量的鉴定出一系新结构的正向调节剂。可以想象，如果是传统的化学合成，想要得到38400个化合物，不仅难度大而且会消耗大量的时间，通过点击化学这种高效反应不仅大大减少了工作量缩短时间，也能更高效率的检测到正向调节剂。

2.     SPAAC 无铜点击
   与铜催化点击对应的是另一条主力路线——SPAAC 无铜点击。这条路线是活细胞/活体首选，因为无铜反应可直接在细胞表面乃至活体内做标记。这个反应的原理是DBCO（环张力大）+ N3无需铜催化即可与叠氮发生 [3+2] 环加成，生成稳定三唑。

SPAAC 无铜点击的实验室操作注意点是普通直线链炔基反应不等于无铜反应，无铜反应必须用应变环辛炔，随着科学家不断的发现，现在有非常多的这个环炔结构可以参与这个反应，只是反应效率有所差别。目前反应效率最高的，也是最常用的就是DBCO。

SPAAC 无铜点击反应中环炔本身的结构张力会比线性炔基要大很多，所以说反应效率更快。整个的SPACC的催化过程基本上在30分钟左右就可以完成，前面提到的铜催化的点击化学，它可能需要1~2个小时才能反应完全。因为无铜点击反应的这个优势，反应非常的简单，所以说其实它是对生物体系来说更友好的一种点基化学反应，再者它无毒，而且叠氮基的体积非常小，所以说当它进入细胞或者体内代谢的时候基本上不会受到太大的影响。非常适合在活细胞或者动物中应用。
        2017年发表在ACS nano上的一篇文章，文章中的案例利用的就是SPAAC 无铜点击反应，反应在小鼠体内完成。科学家用两步法的方式，先后两步给小鼠注射点击化学试剂，第一步注射的是叠氮糖，叠氮糖以进入到细胞内，发生代谢，从而把叠氮基代谢到靶向标记的细胞上，在注射了叠氮糖4天之后，叠蛋糖已经富集到了靶向位点，也就是富集到肿瘤部位。再静脉注射DBCO基团修饰的环形炔修饰的治疗材料，这里是一个附载锌离子的纳米颗粒。之后小鼠的体内来发生了生物正交反应，通过这样的方式来实现对于肿瘤部位的一个靶向递送和治疗。这种方式相较于传统的小鼠给药之前就把这两个材料连接在一起的偶联方式，它的优势是非常明显的。首先，这种方式可以做双靶向的设计，因为叠氮糖和DBCO材料表面都是负载有靶向基团的，所以两个材料它都富集在肿瘤部位的概率会高很多。其次，如果先把两个基团结合在一起，会形成一个大分子，大分子在小鼠体内的生物利用率是比较低的，在进入体内代谢的时候也会遇到一些其他的问题。所以说这种点击策略可以让我们实现高效且精确的对于靶向位点，无论是肿瘤区域还是其他的一些区域的快速药物递送，提高生物利用率。

         3.     逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应（IEDDA）
        第三条路线是目前比较新颖的路线—逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应（IEDDA）。它的反应原理是通过一个电子缺陷的四嗪和电子富集的烯烃、炔烃进行环加成反应，生成一个稳定的六元氮杂环。这个反应中四嗪和烯烃的结构复杂，结构的稳定性也比叠氮和炔基的的稳定性差很多，反应速率极快，相对的合成成本和使用成本也高很多。这就导致虽然这个反应也是无毒的反应，但在实际生产和应用中需要进行相对应的考量和评估。

2015年发表在jacks上的一篇文献就很直观的体现了iEDDA这个反应的高速。文献将当时很热门的HaloTag的技术和点击化学进行了一个融合，在这个HaLoTag的标签上分别修饰了DBCO的荧光团和TCo的荧光团，也就是SPAAC的反应所要的原料和iEDDA反应所需要的原料，然后分别和叠氮基团修饰的camera或者是四嗪基修饰的camera来和内质网以及胞质内的蛋白进行点击化学的偶联反应。然后通过成像，还有对整个反应速率的检测来对比了这两种不同的点击化学反应，从反应速率角度来看，iEDDA速率是明显更快的。同时从反应的浓度上来看，四嗪基和TCo催化的反应，可以在相对比较低的浓度就达到比DBCO基团更好的效果，同时产物的稳定性也更好。所以说在这个生物体系里，四嗪基的点击化学更加适合这个反应体系。

以上就是对三种点击化学路线的介绍以及简单的示例说明。三种反应路线的原理，反应条件，以及优缺点决定了路线的适配应用场景。

点击化学重新定义了分子拼接的效率与可靠性，三条路线不是替代关系，是互补的工具。目前点击化学已经应用到生物药物，材料科学，探针诊断各个领域，正从试管走向活体，从实验室走向临床。