1) 一对二硫键的形成：

一对二硫键的形成方法相对简单，通常将多肽从树脂上切割下来之后，将多肽溶于合适的溶剂中，使用氧化剂进行氧化即可；反应条件有多种选择，比如空气氧化，DMSO氧化等温和的氧化过程，也可以采用H2O2，I2，汞盐等激烈的反应条件。常用的方法有：

• 空气氧化法:

空气氧化法形成二硫键是多肽合成中最经典的方法，通常是将巯基处于还原态的多肽溶于水中，在近中性或弱碱性条件下（PH值6.5-10），反应24小时以上。为了降低分子之间二硫键形成的可能，该方法通常需要在低浓度条件下进行。

• 碘氧化法:

将多肽溶于25%的甲醇水溶液或30%的醋酸水溶液中，逐滴滴加10-15mol/L的碘进行氧化，反应15-40min。当肽链中含有对碘比较敏感的Tyr、Trp、Met和His的残基时，氧化条件要控制的更精确，氧化完后，立即加入维生素C或硫代硫酸钠除去过量的碘。

2) 多肽对二硫键的形成：

当序列中有两对或多对二硫键需要成环时，通常有两种情况：

• 自然随机成环:

序列中的Cys之间随机成环，与一对二硫键成环条件相似；

• 定点成环:

定点成环即序列中的Cys按照设计要求形成二硫键，反应过程相对复杂。在固相合成多肽之前，需要提前设计几对二硫键形成的顺序和方法路线，选择不同的侧链巯基保护基，利用其性质差异，分步氧化形成两对或多对二硫键。通常采用的巯基保护基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob, Meb、TMTr、Npys等多种基团。

几种常用的多对二硫键成环策略

二硫键最重要的一个特性就是它在还原剂作用下的裂解。使二硫键裂解的还原剂较多。在生物化学中，常用的还原剂有硫醇如β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）或二硫苏糖醇（DTT）。通常要使用过量硫醇试剂保证二硫键的完全裂解。其它还原剂还有三（2-羧乙基）膦[ tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP]，与β-ME和DTT不同，TCEP无味，有选择性的，可以在碱性和酸性环境下工作（不像DTT），更亲水性，耐氧化。此外，在蛋白硫醇修饰前，通常不需要去除TCEP。

生物体内通过硫醇和二硫键交换形成的二硫键的氧化和还原变化受到一种硫氧还蛋白的促进。这种小蛋白在所有已知的生物体中都是必需的，它包含两个半胱氨酸氨基酸残基，以邻近的方式排列（一个挨着一个）。这使得它可以形成一个内部二硫键，或者与其他蛋白质形成一个非内部二硫键。因此，它可以作为还原型或氧化型二硫键的存储库。

• 二硫键成环合经验丰富，合成策略多，技术成熟

• 严格的质量检测，包括质谱检测和HPLC检测，对于多对二硫键成环，每个位点成环都将提供质谱验证报告

• 纯度>95%